Proyecto: Desarrollo de estrategias novedosas para la degradación dirigida de proteínas en plantas mediante dTAG y HaloTag.
Investigadores: Lidia Orea Ordóñez y Jorge Lozano Juste.
Los PROTACs (PROteolysis TArgeting Chimeras) son moléculas químicas capaces de degradar proteínas de manera dirigida. Constan de 3 partes: una que se une a la proteína diana, otra que se une a una E3-ligasa y un linker conectando ambas partes. Los PROTACs aproximan la proteína diana a la E3-ligasa, desencadenando su ubiquitinación y degradación por el proteasoma. Estas moléculas ofrecen una alternativa muy ventajosa frente a los inhibidores tradicionales y aunque se conocen ampliamente en biomedicina, los PROTACs aún no se han aplicado en plantas.
En este proyecto de TFM se explorarán los sistemas dTAG y HaloTag (Fig. 1) como herramientas de degradación dirigida de proteínas en plantas. El sistema dTAG se basa en la fusión de la proteína diana a una variante de la proteína FKBP12 (FKBP12F36V). El compuesto químico AP1867, presenta afinidad nanomolar por FKBP12F36V y se ha combinado con pomalidomida para generar dTAG13, un PROTAC comercial. Este induce la formación del complejo ternario proteína diana-FKBP12F36V + dTAG13 + E3-ligasa (CRBN) (Fig. 1A) y la posterior ubiquitinación y degradación de la proteína de fusión en modelos animales. Hemos obtenido resultados preliminares en protoplastos de Arabidopsis que muestran que la proteína de fusión GFP-FKBP12F36V se degrada en un plazo de 4 horas tras el tratamiento con 50 nM de dTAG13, en colaboración con el Prof. Marco Trujillo (Hamburgo, Alemania).
Por otro lado, el sistema HaloTag es la segunda plataforma basada en etiquetas más utilizada para el desarrollo de PROTACs. HaloTag es una proteína que se une de manera muy eficiente e irreversible a compuestos con cloroalcanos. Estos compuestos se han combinado con pomalidomida para generar HaloPROTACs, que inducen la degradación de proteínas fusionadas a HaloTag (Fig. 1B).
En este TFM se utilizarán líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan GFP fusionada a las etiquetas dTAG (35S::GFP-FKBP12F36V) y HaloTag (35S::GFP-HaloTag) para analizar la degradación de GFP (Fig. 1). Los niveles de GFP se analizarán mediante western-blot con anticuerpos específicos y microscopía confocal, tras el tratamiento con dTAG13 y HaloPROTAC. El uso de mutantes y tratamientos con inhibidores del proteasoma ayudará a confirmar los resultados. Además, se llevará a cabo el clonaje y validación de nuevas fusiones con las etiquetas dTAG y HaloTag y se estudiará su producción como proteínas recombinantes.
Figura 1. Representación de los sistemas de degradación dirigida de proteínas dTAG (A) (Nabet et al., 2018) y HaloTag (B) (Ody et al., 2023).
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