Plant Stress Biology

This department consists of researchers whose goal is to decipher at the molecular level the interaction between plants and external factors, biotic and abiotic, which limit their development and agronomic performance. With this research, we intend to develop new plant varieties more productive and resistant to biotic and environmental stresses.

 

Research Areas

1- Plant-pathogen interaction

This research line aims to understand, at the molecular and cellular levels, the interaction between host plants and their many pathogenic organisms, such as nematodes, fungi, oomycetes, bacteria, viruses, and viroids. On the one hand, we want to understand the biology, epidemiology, and rapid evolution of these pathogens in order to develop biotechnological strategies for disease early diagnosis and crop protection. On the other hand, we want to understand the host plant defensive response to these pathogens to improve it and to obtain more resistant crop varieties.

Research groups

El trabajo del grupo se dirige fundamentalmente al estudio de los factores que determinan la infección/acumulación de un virus en un huésped determinado. Como dicha acumulación será esencialmente el resultado del balance entre multiplicación viral y degradación, nuestra atención está centrada en los acontecimientos que influencian estos dos procesos. Concretamente, estamos priorizando el análisis de los mecanismos de replicación, transcripción y traducción de genomas virales así como de las estrategias desarrolladas por el patógeno para suprimir la respuesta defensiva del huésped basada en silenciamiento por RNA.

Como modelos, estamos utilizando pequeños virus con genoma de RNA, pertenecientes a la familia Tombusviridae, que se caracterizan por poseer un genoma relativamente sencillo lo que facilita los abordajes experimentales. De forma sucinta, las líneas de investigación actuales serían:

1) Identificación y caracterización de elementos estructurales del RNA viral y de factores proteicos (virales/celulares) implicados en la regulación de los procesos de replicación, transcripción y/o traducción de virus.

2) Estudio de la función viral de supresión del silenciamiento por RNA.

3) Análisis de la posible interferencia de la infección viral con rutas de silenciamiento del huésped.


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Las plantas son huéspedes de una gran variedad de agentes infecciosos, los cuales frecuentemente causan un enorme daño en los cultivos y los ecosistemas naturales. El primer objetivo de nuestro grupo de investigación es entender los mecanismos moleculares que subyacen a la interacción entre las plantas y algunos de estos patógenos como son los virus y los viroides.

A partir de este conocimiento esperamos desarrollar nuevas estrategias biotecnológicas para la protección e innovación en los cultivos. Además, creemos que las extraordinarias propiedades biológicas de los virus y viroides se pueden aprovechar convirtiéndolos en útiles instrumentos biotecnológicos. Nuestro segundo objetivo es desarrollar sistemas para producir productos de interés (metabolitos, RNAs, proteínas, anticuerpos…) en plantas biofactoría utilizando virus y viroides convenientemente manipulados.

Nosotros imaginamos un futuro en el que las plantas cultivadas serán la fuente más fiable y sostenible de alimento, forraje, fibras, combustible y productos químicos y farmacéuticos para la humanidad.

Líneas de investigación:

Más concretamente, algunas de las investigaciones que actualmente están en marcha en nuestro grupo tienen como objetivo:

1. Descifrar como los RNAs viroidales son capaces de replicarse en las células de las plantas. Ver Cordero et al. 2018, Front. Microbiol.

2. Entender la respuesta defensiva de las plantas a la infección viral. Ver Cordero et al. 2017, Mol. Plant Microbe Interact.

3. Identificar genes de resistencia a la infección viral. Ver Aragonés et al. 2018, Eur. J. Plant Pathol.

4. Desarrollar estrategias biotecnológicas para proteger a las plantas de los virus y viroides. Ver Carbonell et al. 2017, Mol. Plant Pathol.; or Carbonell et al. 2018, Mol. Plant Microbe Interact.

5. Producir carotenoides y antocianinas saludables en plantas utilizando vectores virales. Ver Majer et al. 2017, Sci. Rep.; or Cordero et al. 2017, Front. Microbiol.

6. Producir grandes cantidades de RNAs recombinantes utilizando un sistema derivado de un viroide. Ver Daròs et al., Sci. Rep.

7. Desarrollar vectores virales para producir proteínas recombinantes en plantas. Ver Majer et al. 2015, Biotechnol. J.; or Shi et al. 2018, Plant Biotech. J.

8. Construir circuitos genéticos sintéticos para regular la expresión génica en plantas. Ver Cordero et al. 2018, ACS Synth. Biol.


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La investigación de nuestro grupo se centra en el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia de las plantas a agentes bióticos (viroides, virus, bacterias, hongos) empleando abordajes bioquímicos, moleculares y metabolómicos, con el objetivo de conocer la función de genes, proteínas y metabolitos implicados en la respuesta de la planta al ataque por distintos patógenos.

En la actualidad, estamos explorando la implicación, tanto en la comunicación intra como inter planta,  de tres grupos de moléculas señal  que participan en la respuesta del tomate contra las bacterias: (1) el ácido salicílico y su éster metílico, (2) monoterpenoides y ( 3) ésteres de volátiles de hojas verdes.

1.– Hemos llevado a cabo un análisis metabólico mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas en la respuesta defensiva de plantas de tomate ‘Rio Grande’ Pto infectadas con dos cepas de la bacteria patógena Pseudomonas syringæ pv. tomato DC3000. Una de ellas es portadora del gen AvrPto y como consecuencia la planta es resistente a la infección (interacción incompatible), mientras que la otra que no contiene dicho gen, da lugar a una interacción compatible con fuertes síntomas en las hojas infectadas. La comparación de los perfiles metabolómicos de hojas infectadas con uno u otro tipo de bacterias reveló diferencias muy significativas entre los compuestos volátiles (VOCs) asociados a cada tipo de infección. En concreto, en la interacción incompatible, las hojas emitían ésteres del (Z)-3-hexenol, tales como acetato de (Z)-3-hexenilo y butanoato de (Z)-3-hexenilo, así como monoterpenos hidroxilados, como α-terpineol, 4-terpineol y linalool. En cambio, en la interacción compatible, con fuertes síntomas de la enfermedad bacteriana, se observó la emisión de salicilato de metilo y monoterpenos como el limoneno y el α-pineno (López-Gresa et al. 2017).

Además, hemos encontrado que algunos de estos VOCs muestran actividad antibiótica in vitro contra Pseudomonas y que el tratamiento exógeno de las plantas de tomate con estos compuestos provocaron la inducción de genes defensivos y el cierre de estomas en hojas de tomate, así como un aumento muy significativo de la resistencia de dichas plantas a la infección por Pseudomonas (López-Gresa et al. 2018). Estos resultados sugieren que estos VOCs podrían tener un doble papel en plantas de tomate: como moléculas protectoras y como inductores de defensa. Además, debido a su naturaleza química, también podrían desempeñar una función biológica en la comunicación entre plantas a través de la atmósfera. Hemos presentado una patente (PCT / ES2018 / 070) sobre el uso y el método de aplicación del butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) como un metabolito inductor del cierre de estomas para proteger las plantas contra el ataque de patógenos en general y sequía. Además de este papel biológico, nuestros últimos resultados (Payá et al. 2020) muestran que la aplicación exógena de HB en vid (Vitis vinifera) acelera la maduración.

2.- Hemos demostrado la inducción de la expresión de diferentes factores de traducción y proteínas ribosómicas como consecuencia de la infección por Citrus Exocortis Viroid (CEVd) en plantas de tomate. Este resultado indica que un patógeno no codificante causa cambios en la maquinaria transcripcional. En particular, se identificaron los factores de alargamiento 1 y 2 (eEF1A y eEF2) y el factor de iniciación de la traducción 5-alfa (eIF5A). Así mismo, se demostró una interacción reproducible entre eEF1A y el CEVd (Lisón et al. 2013).

Más recientemente hemos demostrado que el CEVd produce estrés ribosomal en plantas de tomate (Cottilli et al. 2019). Nuestros últimos resultados (Vazquez et al. 2020) empleando mutantes de tomate Never ripe (Nr) insensibles a etileno sugieren un papel importante de esta fitohormona en el estrés ribosomal causado por la infección viroidal.

3.- Hemos demostrado el papel de flavonoides y amidas de ácidos hidroxicinámicos (HCAA) en la defensa de plantas de tomate contra virus (Campos et al. 2019) y la bacteria patógena Pseudomonas syringae DC3000 (Zacarés et al. 2007, López-Gresa et al. 2011, Campos et al. 2014b), respectivamente.

Hemos identificado nuevos compuestos de naturaleza fenólica cuya síntesis es inducida tanto en interacciones compatibles como de naturaleza incompatible entre plantas de tomate y determinados patógenos. Uno de estos metabolitos, la trans-feruloilnoradrenalina (t-FNA), es un nuevo compuesto con una potente actividad antioxidante (Patente Internacional WO2011ES70269 20110415). Las plantas transgénicas de tomate que sobreexpresan el gen THT, un gen clave para la biosíntesis de HCAA, mostraron una mayor resistencia a Pseudomonas syringae DC3000.

4.- Hemos obtenido evidencia sólida de que el ácido gentísico (GA), un derivado metabólico del ácido salicílico (SA), actúa como una señal complementaria adicional al SA para activar las defensas de las plantas de tomate contra los patógenos (López-Gresa et al. 2016; Bellés et al. 1999). También hemos encontrado que GA y SA podrían tener un papel como moléculas señal en el silenciamiento del RNA contra virus y viroides (Campos et al. 2014a, López-Gresa et al. 2016). Más recientemente, hemos demostrado que el GABA juega un papel defensivo en la respuesta de plantas de tomate al CEVd (López-Gresa et al. 2019).


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PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN

  1. Caracterización de los genes y funciones esenciales en el ciclo infeccioso de virus pertenecientes a los grupos de los Ilar y Carmovirus que afectan de manera importante a árboles frutales y cultivos de interés agrícola.
  2. Estudios sobre el movimiento intra- e intercelular de virus y viroides en sus huéspedes susceptibles.
  3. Tráfico de proteínas y RNAs a través del floema.
  4. Silenciamiento de RNA en el proceso de patogénesis de virus y viroides.
  5. Desarrollo y mejora de nuevos métodos de diagnosis viral basados en el componente genómico de los virus.

COLABORACIONES CON EMPRESA

La profundización en el conocimiento de los mecanismos de expresión de virus que afectan a árboles frutales, a ornamentales y a especies hortícolas ha posibilitado su aplicación a resolver aspectos prácticos de ciertas virosis problemáticas para el Sector socioeconómico correspondiente. Se han establecido diversos convenios de investigación y transferencia de resultados con empresas y/o organismos públicos: Barberet y Blanc S. A., Primaflor S.A.,  FECOAM, Agromillora Catalana S.A., Laboratorio de Sanidad Vegetal-Tenerife, Laboratori de Sanitat Vegetal-Barcelona; Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón-Zaragoza, Centro Nacional de Semillas y Plantas de Vivero-Zaragoza.


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El desarrollo de técnicas de secuenciación masiva de ácidos nucleicos ha permitido descubrir nuevas formas y rutas de regulación de la expresión génica tanto de seres vivos como de agentes virales. Toda esta información nos está permitiendo entender mejor la elevada complejidad de toda entidad biológica sobre el planeta, y hace replantearnos tanto el concepto clásico de gen como la función de cada par de bases de un genoma. Dentro de esta revolución destaca el papel central que el RNA desempeña en multitud de procesos biológicos e infecciosos. Nuestro grupo está interesado en encontrar y caracterizar nuevas funciones biológicas para los RNAs no codificantes, centrándonos especialmente en sus capacidades catalíticas (ribozimas) y reguladoras (riboreguladores), así como en explotar biotecnológicamente cualquiera de los nuevos motivos de RNA detectados. Para todo ello, en el laboratorio utilizamos aproximaciones multidisciplinares que combinan la Bioinformática, Bioquímica y Biología Molecular y Estructural, y empleando fundamentalmente las plantas como sistema biológico experimental de referencia. Entre las líneas de investigación específicas que seguimos en la actualidad destacarían:

  • Encontrar y caracterizar el genoma de todos los virus y RNAs infecciosos del planeta a traves de aproximaciones de computación en la nube (de la Peña et al. Cells 2020; de la Peña et al. Virus Evol 2021; Edgar et al. Nature 2022).
  • Entender el funcionamiento y papel biológico de los RNAs circulares con ribozimas codificados en genomas de plantas y animales (Cervera et al. Genome Biol 2016; de la Peña y Cevera. RNA Biol 2017; Cervera y de la Peña, Nucl Acids Res 2020).
  • Exploración bioinformática y caracterización de nuevos motivos de RNA catalíticos y reguladores (de la Peña et al. Molecules 2017).
  • Caracterización funcional de pequeños ribozimas asociados a retrotransposones (Cervera y de la Peña, Mol Biol Evol 2014).
  • Descifrar el papel de los ribozimas del genoma humano conservados en intrones de antioncogenes y antígenos tumorales (de la Peña, García-Robles. EMBO Rep 2010; de la Peña et al. Biol Chem 2012; de la Peña, Ribozymes-Chapter 11 2021)
  • Desarrollo de posibles herramientas biotecnológicas basadas en RNAs circulares con ribozimas para terapias génicas (de la Peña. Adv Exp Medicine Biology 2018)

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2- Response to environmental stress and climate change

This research line aims to understand the molecular mechanisms underlying the cellular response to a variety of abiotic challenges, namely ion, cold, chemical, osmotic and drought stress, as well as nutrient starvation. We use a combination of biochemical, genetic, and genomic methods to identify the molecular determinants and regulatory circuits that facilitate the adaptation of plants to adverse conditions. The knowledge of these determinants and their regulatory interactions will provide tools to improve the tolerance of crops to abiotic stress conditions.

Research groups

Biological innovation has been defined as the acquisition of new functions, but, how they arose? how are they incorporated into a given biological system? or how can them be modulated to respond to environmental challenges?These are the question the group aims to answer.

My research deals with this idea of unveiling biological innovation mechanisms by applying integrative system biology approaches under different stresses using microorganisms as models, and by applying experimental evolution to observe evolution in action or to replay what has been observed or what is modelled.

> Microbiome as part of a whole. Microorganisms have been at the forefront of insects’ specialization (as clear example the interaction and specialization of aphids with Buchnera aphidicola and other microorganisms, as highlighted in my PhD thesis). Nowadays microbiome studies have highlighted their importance in many other species, from corals to humans, or including an important research line of Horizon Europe project, linked to ‘One Health’, microbiome composition of soil and/or phytobiome as special point to plant protection and health, as with the problem with Xylella fastidiosa. In this last point, we are integrated in the PTI-Xylella, with a new set up BSL-2 lab.

> GroEL-driven functional innovation. Molecular chaperones like GroEL have been implied in the maintenance of biological system under strong deleterious mutations accumulation regimes, either imposed (like vertical transmission of (endo)-symbionts in aphids) or under experimental evolution. And seems that is the driver of functional innovation on these species, as this protein has other moonlighting functions that should be unveiled and that can have biotechnological applications (like microorganism improvement as biofactories). Indeed, GroEL can be used as trap for other microorganisms, or used as biological weapon (as already done by antlions). Even more, GroEL is a central hub in bacterial proteome, not only working on heat stress relieve, it is involved in mutational buffering effects on a big number of client proteins, many of them essential for microorganism survival (PhD thesis project of Roser Montagud). We have identified a side-effect of this mutational buffering, affecting the antibiotic resistance profile of the evolved lines (RM thesis). The characterization of interaction between mutational buffering and antibiotic resistance networks will unveil new drug targets, new antimicrobial molecules or new moonlighting functions for GroEL.

> Gene duplication as source of functional innovation (with Dr. C. Toft, I2SysBio). Functional innovation through gene duplication has been a paradigm over the last 40 years (whole genome or small scale duplications events), being behind many of the major steps in evolution (rise of flowering plants, appendices in vertebrates, etc). Over the last 5 years we have unveiled that genes keep as duplicates are involved in stress response in yeast (F. Mattenberger’s PhD thesis) with differences between SSDs and WGDs, and identifying mutational hotspots that increases the functional divergence between copies. A core stress-response has been unveiled, and remain one the on-going projects with yeasts.

> Oxidative stress as driver for functional innovation (with Dr. C. Toft and Dr.s M. Miguel, CIAL and M. Garcés, UFV). Oxidative stress has been highlighted as central for cell evolution, ageing or longevity linked studies. Here applying all our knowledge on oxidative stress response and characterization of their effects on phenotypes, we are able to unveil basic mechanisms involved in ageing, or in the relief of oxidative stress with biotechnological applications in the field of biomedicine.


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Interés

Biología Molecular de levadura para la obtención de herramientas biotecnológicas con aplicación en el sector agroalimentario y sanitario.

Líneas de investigación

PRODUCCIÓN DE PEQUEÑOS FORMATOS DE ANTICUERPOS EN LEVADURAS FRENTE A DIFERENTES BACTERIAS DEL SECTOR GANADERO

HOMEOSTASIS MITOCONDRIAL Y ACTIVACION GENICA DURANTE EL ESTRES CELULAR, EL ENVEJECIMIENTO Y LA EVOLUCION


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GENERAL DESCRIPTION OF SCIENTIFIC INTERESTS:

Ion homeostasis is a dynamic process and a fundamental requirement for all organisms. Many different minerals are required for essential biochemical processes, but the accumulation of these elements is toxic. Thus, all living organisms have developed efficient systems to acquire and store these elements and robust mechanisms to maintain homeostatic concentrations to avoid toxicity and to respond to environmental changes.

Potassium is a key monovalent cation necessary for multiple aspects of cell growth and survival, for example, compensation of negative charges of macromolecules, maintenance of electroneutrality, cell turgor and volume, enzyme activity, protein synthesis, and maintenance of proper membrane potential and intracellular pH. The long-term, general goal of our research group is to generate new knowledge regarding the regulation of potassium transporters from both plants and yeast which may be applied in future in biotechnological approaches to improve plant drought tolerance.

CURRENT PROJECTS:

We are currently undertaking two major research endeavors. One is centered on basic science and the generation of new knowledge and the other is more applied and carried out in collaboration with an industry partner. Both are related to studies of the molecular mechanisms involved in plant stress responses, especially abiotic stress. Our research interests can be summarized as follows:

Basic Science:

In plants, apart from the basic, general physiological functions listed above for potassium at the cellular level, this cation also plays a key role at the whole plant level, as it is involved in important processes such as stomatal aperture that controls transpirational water loss and plant desiccation. Inward rectifying channels are responsible for potassium influx into guard cells and play a key role in stomatal opening. KAT1, and its close homologue KAT2, are the main inward rectifying channels expressed in guard cells. Our current project is focused on the characterization 14 proteins that we have identified in a Split-Ubiquitin protein-protein interaction screen searching for KAT1 potassium channel interactors from the model plant Arabidopsis thaliana.

We are taking several biochemical and genetic approaches to confirm these interactors and their effect on KAT1 activity in plants. The identification of physiologically relevant regulators of K+ channels will aid in the design of approaches that may impact both drought tolerance and pathogen susceptibility since these pores are responsible for CO2 uptake and transpirational water loss and are the point of entry for certain pathogens.

Applied science with industry partners:

Our second major focus, initiated in 2018 in collaboration with the SAKATA company, is to analyze the proteomic and metabolomic profiles of different broccoli cultivars with varied tolerance to different abiotic stresses (drought and salinity). The aim is to identify proteins and/or metabolites with differential accumulation that can be used to predict the performance of uncharacterized cultivars in adverse field conditions. As a complementary approach, we will take advantage of our expertise using the baker’s yeast model system to overexpress genes from a tolerant broccoli cultivar to identify genes that are able to confer tolerance to salt and drought stress. Using these approaches, we hope to provide SAKATA with a battery of tools that can be used both for cultivar selection and breeding programs.

We have also developed a system for a fast and cheap evaluation of natural extracts with the potential to be used as biostimulants, based on the use of the model systems Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae. We have used this system to evaluate products provided by different companies and to design novel formulates. Currently, in collaboration with the company CALDIC, we are deciphering the molecular basis of the abiotic stress tolerance conferred by the novel formulations of biostimulants, and performing field tests to evaluate its efficiency for different crops.


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El grupo de “Homeostasis Iónica, Estrés Celular y Genómica” tiene como objetivo identificar las bases moleculares de la homeostasis de cationes monovalentes (H+, K+, Na+)  y de los mecanismos de tolerancia a estreses abióticos como la sequía, salinidad, calor, frío, acidez y ambientes oxidantes. Ambos aspectos están relacionados pues durante los estreses celulares hay señales tempranas basadas en flujos opuestos de H+ y K+ y cambios de potencial eléctrico en la membrana plasmática. Por otra parte, el transporte de H+ y K+ regula la tolerancia a estreses, el crecimiento y la muerte celular. Finalmente, es de destacar que los fenómenos biológicos se estudian mejor en condiciones de estrés, que ponen de manifiesto las armas más poderosas de los seres vivos.

Los sistemas modelos empleados en estas investigaciones son la levadura Saccharomyces cerevisiae y la planta Arabidopsis thaliana. Levaduras y plantas comparten los mecanismos básicos de homeostasis iónica y de tolerancia a estreses y ofrecen ventajas experimentales complementarias.

La metodología empleada es doble: a) genómica funcional para identificar genes cruciales para la homeostasis iónica y tolerancia a estreses abióticos; b) biología molecular y bioquímica para descifrar los mecanismos de los genes anteriores a través de sus proteínas codificadas.

La genómica funcional tiene para nuestro grupo dos ramas complementarias: a) genómica de expresión global de genes mediante micromatrices (“microarrays”); b) genómica de mutación global de genes y selección.

En ambos casos se exponen levaduras o Arabidopsis a situaciones de estrés y se determinan: a) genes regulados, que definirán los mecanismos transcripcionales de respuesta. Esta aproximación está limitada por el hecho conocido de que mucho genes no regulados a nivel transcripcional son sin embargo importantes en los fenómenos biológicos. Por otra parte, muchos genes regulados son poco relevantes para el fenómeno en cuestión; b) mutantes tolerantes se seleccionarán a partir de mutantes marcados (por plásmidos en levadura o por T-DNA en Arabidopsis), que permiten una fácil identificación de los genes responsables.

Los resultados de estas aproximaciones son nuevos genes y mecanismos de respuesta a estreses en levadura y Arabidopsis. Estos conocimientos proporcionan herramientas biotecnológicas para aumentar la tolerancia a estreses en plantas cultivadas y levaduras industriales y dan lugar a patentes.

HISTORIA Y PRINCIPALES LOGROS DEL PASADO

La formación científica de Ramón Serrano (RS) se realizó con tres grandes maestros de la biología moderna: el enzimólogo español Alberto Sols, el bioquímico de membranas norteamericano Efraim Racker y el biólogo molecular norteamericano Gerald R. Fink. La labor investigadora de RS durante más de 25 años puede resumirse como el estudio de los mecanismos de la homeostasis de cationes (H+, K+, Na+) y sus implicaciones en la regulación del crecimiento celular y la tolerancia a estreses.

El primer logro como científico independiente de RS fue la caracterización de la bomba de protones de levaduras y plantas. En las células animales el danés Jens C. Skou (premio Nobel de Química de 1997) había descubierto a finales de los años 50 una ATPasa que acoplaba la hidrólisis de ATP al movimiento de sodio y potasio a través de la membrana plasmática. Sin embargo esta enzima no existe en hongos ni plantas. Los trabajos bioquímicos de RS a principios de los años 80 fueron decisivos para demostrar que la membrana plasmática de hongos y plantas está energizada por una ATPasa electrogénica bombeadora de protones, distinta por tanto de la ATPasa animal identificada por Skou. Estos trabajos se basaron en la purificación de la H+-ATPasa y en la reconstitución de proteoliposomas que catalizaban un bombeo de protones energizado por ATP.

RS fue también pionero en el aislamiento y caracterización del gen que codifica para esta enzima, primero en levadura (1986) y luego en la planta Arabidopsis (1989). La mutagénesis dirigida y al azar del gen de la H+-ATPasa de levadura permitieron definir sus residuos clave así como los dominios funcionales “kinasa” y “fosfatasa” que catalizaban las dos semi-reacciones del ciclo catalítico, con formación e hidrólisis de un intermediario fosforilado. La reciente cristalización de varias enzimas homólogas (la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico sobre todo) ha confirmado la validez de estos postulados.

La manipulación genética de la H+-ATPasa de levadura estableció una correlación entre crecimiento celular y actividad de la bomba de protones. El mecanismo estaría basado tanto en la energización del transporte activo de nutrientes como en la regulación del pH intracelular, un factor clave en la transición G0/G1 del principio del ciclo de división celular de todas las células eucarióticas. Estos resultados pudieron ser parcialmente extrapolados a animales y plantas: la expresión del gen de la H+-ATPasa de levadura en fibroblastos de ratón resultaba en un aumento tanto de su pH intracelular como de su capacidad de crecimiento y en plantas existe una correlación entre el efecto de la hormona de crecimiento auxina y la activación de la H+-ATPasa.

En los años 90 RS inició los estudios de la homeostasis de sodio y potasio con el modelo de levadura, identificando un conjunto de nuevos reguladores codificados por los genes de halotolerancia llamados HAL. La primera diana celular de la toxicidad del Na+ es el producto del gen HAL2. Se trata de una nucleotidasa sensible a litio y sodio que es necesaria para detoxificar un metabolito intermediario, el difosfato de adenosina o PAP, que es altamente tóxico para diversos procesos celulares. RS ha caracterizado una nueva familia de enzimas, las PAP fosfatasas, en animales y plantas. En los primeros resultan ser nuevas dianas, además de la tradicional inositol monofosfatasa, durante la terapia de litio empleada en la enfermedad bipolar. En las segundas, son dianas de la toxicidad del sodio durante el estrés salino.

Los productos de los genes HAL1 HAL3HAL4 y HAL5 definen una importante ruta de regulación del transporte de potasio que determina el potencial eléctrico de la membrana y por tanto la toma de cationes tóxicos como litio y sodio. Además estos genes modulan el pH intracelular y la turgencia, definiendo conexiones entre el transporte de potasio, el ciclo de división celular y la regulación de la estabilidad osmótica. El gen HAL3 codifica una nueva flavoproteina que regula tanto el transporte de sodio y potasio como el ciclo celular a través de una proteina fosfatasa de tipo 1 (Ppz1). HAL8/CRZ1 codifica un factor de transcripción que media la acción de la proteina fosfatasa activada por calcio “calcineurina”. Finalmente, el factor de transcripción Sko1 ha sido caracterizado por RS como un represor génico contrarrestado por estrés salino a través de una ruta de MAP kinasas, la ruta HOG. Tanto Hal8 como Sko1 regulan al gen de la bomba de sodio de levadura ENA1.

En levadura RS ha identificado varias proteína kinasas (Ptk2, Hal4, Hal5, Snf1, Sky1) y fosfatasas (Ppz1, Glc7) que regulan el transportador de K+ Trk1 y la H+-ATPasa Pma1. Hal4 y Hal5 también regulan muchos otros transportadores de levadura. Hal3 es una subunidad inhibidora de Ppz1, que a su vez inhibe al transportador de potasio Trk1. Al acidificarse el interior celular Hal3 se une a Ppz1 e impide que inhiba Trk1. El transporte de K+ permite así el balance eléctrico durante la salida de H+ mediada por Pma1. Cuando el pH intracelular vuelve a la neutralidad, Hal3 se separa de Ppz1 que entonces inhibe Trk1 y se para el intercambio salida H+/entrada de K+. Se trata de uno de los primeros sensores de pH identificados a nivel molecular.

FILOSOFÍA DE LA INVESTIGACIÓN

Según Peter Medawar, “la investigación científica es el arte de encontrar problemas importantes que se pueden resolver con las herramientas disponibles”. Pero hay también un aspecto más teórico, resumido por Francis Bacon al decir que “la verdad está más cerca del error que de la confusión”. Es decir, al abordar esos problemas solubles, debemos partir de hipótesis originales que al ser contrastadas supongan un avance importante del conocimiento. Y si son refutadas por erróneas al menos habrán servido de estímulo intelectual. Porque al fin y al cabo, aunque la ciencia sirva al progreso de la sociedad, el motor de todos los descubrimientos importantes ha sido la curiosidad de los científicos por entender la naturaleza. Y aunque el destino no nos lleve a esos descubrimientos importantes necesitamos el estímulo intelectual de poder aspirar a ellos.

LINEAS DE INVESTIGACIÓN ACTUALES

a) acidificación intracelular

El cambio en la concentración intracelular de H+ (pHi) es una señal asociada a muchos procesos biológicos, como por ejemplo el crecimiento y la muerte celular y la respuesta a muchos estreses. Sin embargo, a diferencia de los cambios en la concentración de calcio libre intracelular, apenas se conocen los sistemas celulares que perciben la señal de pHi. Uno de los pocos ejemplos conocidos es el descrito por nuestro grupo: la interacción entre la proteína fosfatasa Ppz1 y su subunidad reguladora Hal3 en levadura, que se favorece a pH bajos permitiendo la activación del transportador de K+ Trk1 (ver más arriba). El sistema de respuesta a cambios del pHi  deberá regular también a la H+-ATPasa de membrana plasmática y a los sistemas celulares más  sensibles a este parámetro físico-químico, pero se desconocen los mecanismos implicados.

Resultados recientes en levadura indican que la acidificación intracelular moderada tiene como efectos principales la inhibición del transporte de aminoácidos y de las aminoacil-tRNA sintetasas, generándose tRNA descargados. En Arabidopsis hemos identificado nuevos reguladores del transporte de potasio como son la quiescina sulfidril oxidasa QSO2, la prolil isomerasa ROF2 y la beta-adaptina WAT1. La activación de la entrada de potasio es esencial para balance eléctrico durante el bombeo de protones por la H+-ATPasa de membrana plasmática. Hemos demostrado la inhibición de la H+-ATPasa de membrana plasmática de raíces de Arabidopsis por la hormona ácido abscisico, lo que resulta en acidificación intracelular. Esta hormona activa la salida de potasio por el canal GORK y ambos efectos contribuyen a la inhibición de crecimiento. El crecimiento de plántulas mutantes tolerantes a estrés ácido intracelular por aumentar la salida de protones son tolerantes a inhibición por ácido abscísico.

Una acidificación intracelular intensa desencadena la muerte celular programada mediada por acumulación de H2O2 y se han obtenido mutantes tolerantes a este estrés letal y pretendemos caracterizarlos a nivel molecular (identificar  el gen mutado).

Este trabajo se realiza en colaboración con los grupos del IBMCP de José R. Murguía, José M. Mulet y Lynne Yenush,) y con el grupo de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga.

b) poliaminas y litio

Las poliaminas y el litio son cationes tóxicos que actúan a concentraciones bajas sin apenas efectos osmóticos. El sodio, sin embargo, resulta tóxico a concentraciones altas en donde se confunden los efectos tóxicos específicos del catión y el estrés osmótico. Utilizando norespermidina como agente de selección se ha identificado una quiescina-sulfhidril oxidase (QSO2) de Arabidopsis que regula positivamente la carga de potasio en el xilema. De forma indirecta y negativamente QSO2 regula la carga y toxicidad de cationes tóxicos como poliaminas, sodio y litio. Estamos investigando la naturaleza del transportador de potasio regulado por QSO2 en la interfaz simplasto-xilema.

También estamos investigando el mecanismo de toxicidad en Arabidopsis de las poliaminas a concentraciones milimolares. Los datos de transcriptómica apuntan a estrés oxidativo, desnaturalización de proteínas e inhibición de la nutrición de nitrato.

Nuestro grupo ha demostrado que la toxicidad del litio en Arabidopsis se debe en gran parte a la inducción de la producción de etileno. Asimismo, la acumulación de H2O2 en un mutante de catalasa da lugar a resistencia a litio por causar pérdida de sensibilidad al etileno. La hipótesis es que la oxidación de grupos sulfhidrilo sensibles en el receptor de etileno ETR1 impide la unión de la hormona y ello habrá de demostrarse mediante estudios del estado de las cisteinas en ETR1 en condiciones normales y durante el estrés oxidativo.

Este trabajo se realiza en colaboración con el grupo de Pedro L. Rodriguez del IBMCP, de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga y de Kalliopi A. Roubelakis-Angelakis de la Universitad de Creta (Grecia).

c) longevidad de semillas y estreses de envejecimiento

Las semillas de las plantas superiores constituyen un sistema biológico de extrema tolerancia a estreses, incluyendo temperatura y desecación. Estamos utilizando un procedimiento de envejecimiento acelerado de semillas de Arabidopsis para seleccionar mutantes con mayor tolerancia a envejecimiento. Tenemos como genes candidatos tres factores de transcripción (AGL18, ZFHD2 y COG1) y una ubiquitina ligasa de la familia RING (que hemos llamado RSL1).Todos ellos aumentan la tolerancia de las semillas al envejecimiento cuando se sobreexpresan y el mecanismo común es reforzar la cubierta de la semilla durante su desarrollo, especialmente la capa de suberina.

d) señalización por metabolismo de azúcares

La H+-ATPasa de membrana plasmática de levaduras y plantas, junto a otros procesos fisiológicos, está regulada por el metabolismo de azúcares, que afecta el estado de fosforilación de la enzima. Perseguimos la hipótesis de que esta regulación se debe a los intermediarios fosforilados de la glicólisis, que en experimentos “in vitro” actúan como inhibidores de la proteína fosfatasa 1 de levadura.

e) frío

Las levaduras cerveceras tipo “lager” pertenecen a la especie Saccharomyces pasterianus y difieren de las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae en su capacidad para realizar la fermentación en frío (10-14 ºC), lo que es esencial para que los aromas de la cerveza sean adecuados. Los mecanismos de tolerancia al frío parecen tener que ver con la estabilidad de los transportadores de nutrientes durante el estrés, especialmente los transportadores de aminoácidos y de fosfato. Vamos a construir una biblioteca de genes de una levadura cervecera cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado y seleccionar genes que confieran tolerancia al frío tras transformar levadura de laboratorio.

Este trabajo se realiza en colaboración con José M. Mulet del IBMCP y con Alfonso Navarro, del Instituto de Alimentos para el Desarrollo de la UPV.

f) TOR, H+-ATPase y transporte de K+

La proteína kinasa TOR es el controlador maestro del crecimiento celular y por tanto estamos considerando la hipótesis de que debe regular positivamente la H+-ATPasa y el transporte de K+. Experimentos iniciales apuntan a regulación transcripcional de la ATPasa y pretendemos determinar ahora cambios en la cantidad y actividad de la enzima.

Este trabajo se realiza en colaboración con Jose M. Mulet del IBMCP y con Christian Meyer del INRA Versalles (Francia).

g) H2O2 y muerte celular

En levadura, la adición de glucosa en ausencia de otros nutrientes provoca muerte celular programada debida a la acumulación de H2O2. La adición de potasio y la disminución de la actividad H+-ATPasa por mutación, disminuyen la producción de H2O2 y protegen frente a esta forma de muerte celular. Esta protección correlaciona con una disminución del potencial eléctrico de las células. La hipótesis que manejamos es que una NAD(P)H oxidasa desconocida de la membrana de levadura es la enzima productora de H2O2 y que se activa por hiperpolarización. El problema ahora es identificar el gen y la proteína de esta actividad en levadura, un organismo que supuestamente no contiene NADPH oxidasas típicas de hongos filamentosos, plantas y animales.

El H2O2 parece actuar activando la salida del potasio celular a través del canal TOK1 y de los transportadores ENA1 y NHA1. Nuestra  hipótesis es que al salir el K+ se produce la lisis osmótica de la vacuola, liberando las enzimas líticas de la misma e iniciando la autolisis de las macromoléculas celulares. Los productos de digestión salen de la célula a través de los caminos de permeabilidad de la membrana abiertos por el H2O2 y sirven para alimentar células próximas mejor adaptadas. El demostrar esta hipótesis y detallar sus mecanismos va a ocuparnos bastante tiempo.


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OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

El impacto causado por el cambio climático y el aumento de la población, supone un riesgo elevado para la provisión de alimentos basados en la producción agrícola. Esta amenaza nos impulsa a estudiar la respuesta de las plantas a condiciones ambientales desfavorables, con el objetivo de incrementar la producción vegetal en un escenario adverso para la agricultura.

Nuestro objetivo general es el estudio de los mecanismos moleculares de las plantas para regular sus procesos de crecimiento, productividad y adaptación ambiental. El conocimiento generado mediante abordajes multidisciplinares como la genética, bioquímica, fisiología, biología molecular y celular principalmente con la planta modelo Arabidopsis thaliana, ayudará a descifrar los mecanismos implicados.

A nivel subcelular nos centramos en los estudios de proteostasis, es decir, la regulación de la homeostasis de las proteínas, incluyendo los procesos de síntesis, modificación, transporte y degradación. Nuestro laboratorio se centra en el estudio de cómo la proteostasis vegetal define el adecuado balance entre el crecimiento, modulado por los ejes SnRK1-TOR y/o espermidina/eIF5A, y la adaptación a múltiples condiciones de estrés tales como deficiencia nutricional, la sequía o la presencia de agentes patógenos. Dado el alto grado de conservación y relevancia de estos ejes moleculares reguladores entre los eucariotas, esperamos que los resultados obtenidos permitan descubrir principios básicos de regulación celular y, al mismo tiempo, proveer de soluciones biotecnológicas para mejorar la adaptación y tolerancia de las plantas al estrés.

PLATAFORMAS TECNOLÓGICAS. Para llevar a cabo nuestras actividades de investigación, hemos implementado tecnologías para estudios de interacciones proteicas (BiFC) y también para estudios de traducción de alta resolución (Riboseq):

– Estudios de interacciones de proteínas por BiFC (Complementación Bimolecular de Fluorescencia). Hemos diseñado y validado nuestros propios vectores para BiFC (http://www.ibmcp.upv.es/PlantStressProteostasisLabVectors) que permiten la generación de fusiones traduccionales a proteínas fluorescentes mediante tecnología de clonaje Gateway. Estos vectores permiten la visualización de interacciones proteicas in vivo en células vegetales por reconstitución de la fluorescencia.

– Estudios del traductoma mediante perfil de huella ribosomal (Riboseq). Hemos implementado la tecnología Riboseq que permite el estudio global de traducción de ARNm a nivel de sub-codón, por secuenciación masiva de fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas.


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Molecular Mechanisms determining Seed Longevity

Understanding how seeds remain viable for years and how they deteriorate, and why some seeds remain viable longer than others is a fascinating subject that can be studied from the scientific point of view, but also with an enormous potential in oriented research, given the economic importance of the seed market and the low seed life span of many species. Seed longevity can be seen as a process where plant responses to both biotic and abiotic stresses are intermingled. Contrary to classical stress situations, is not the plant, but the metabolically inert dry seed which has to be prepared and resist the stressful conditions. Also peculiar is the fact that the new germinating seed has to cope with the consequences of a stress that occurred to the embryo in the past, not in real time. Moreover, it is an aspect of stress biology that integrates passive and active responses, protection and repair, and where development (seed maturation, germination, plant establishment) and stress research are combined.

 

In the last years, our group has initiated the search of new players contributing to the genetic component of seed longevity. Using the model plant Arabidopsis thaliana, we want to identify genes relevant for resistance to seed deterioration, and to characterise their mode of action. From the scientific point of view, our interest is to understand how the seed is prepared during maturation to cope with aging, and how the emerging seedling repairs the damage accumulated during the aging period.  Currently, several processes are being studied in detail: 1) How the environment during seed development influence seed longevity and other seed properties. We pretend to unravel the effects of the environment during seed development on seed longevity, and to identify the regulatory pathways transducing environmental signals and the downstream processes and genes involved. Our results will allow a major control of seed viability, allowing future improved agricultural practices and seed preservation management programmes.  2) What is the role of flavonoids in seed protection and their connection with testa development. Besides their supposed as antioxidants, these compounds may be acting as signalling molecules  3) We also use natural variation to identify new processed involved in seed longevity. From the oriented point of view, we are interested in knowing why and how different industrial seed treatments and coatings are affecting seed quality, and providing suggestions to seed companies in order to improve seed life span and seed quality.

 

Bacterial Effector and Plant-Pathogen Interaction

The discovery of new translocated plant effectors and the characterization of their activities, or the mechanisms by which they are recognized by the plant immune system is a second line of research in my group. Here, we are focused mainly on citrus-pathogen interactions. Xanthomonas citri is the causal agent of citrus canker. This bacterium uses transcriptional-activator like effectors (TALEs) to facilitate infection. The way the plant activates defence responses in response to specific TALEs has been investigated in our group during the last years. Our main objective here is to identify R genes triggering a hypersensitive response mediated by TALE-avirulence factors. HLB (Huanglongbing) is a devastating disease in Citrus, caused by bacteria of the Liberibacter genus. We are testing the role of putative bacterial effectors using heterologous systems, and using transcriptomics to characterize the plant responses to these bacteria in susceptible and resistant interactions.


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Water availability is a major limitation for crop productivity. Over 34 % of crop and livestock production loss is traced to drought, costing the sector $37 billion overall. Our group applies chemical biology to understand drought tolerance and to develop biotechnological tools to fight climate change. In an attempt to make discoveries with an impact in agriculture, we study different plant species including maize, rice and tomato but also model plants like Arabidopsis and the C4-monocot model Setaria viridis. During the last years we have followed a drug discovery approach to design, screen, synthesize and evaluate small molecules able to activate drought resistance in crops. Structure-guided ligand design is a powerful approach, no frequently used in plant biology, which has allowed us to develop potent ABA-receptor agonists. We are collaborating with the private sector to further improve these compounds. In the next years, we will extend our research to different targets in order to develop novel chemical probes with biotechnological interest.


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