El grupo de “Homeostasis Iónica, Estrés Celular y Genómica” tiene como objetivo identificar las bases moleculares de la homeostasis de cationes monovalentes (H+, K+, Na+) y de los mecanismos de tolerancia a estreses abióticos como la sequía, salinidad, calor, frío, acidez y ambientes oxidantes. Ambos aspectos están relacionados pues durante los estreses celulares hay señales tempranas basadas en flujos opuestos de H+ y K+ y cambios de potencial eléctrico en la membrana plasmática. Por otra parte, el transporte de H+ y K+ regula la tolerancia a estreses, el crecimiento y la muerte celular. Finalmente, es de destacar que los fenómenos biológicos se estudian mejor en condiciones de estrés, que ponen de manifiesto las armas más poderosas de los seres vivos.
Los sistemas modelos empleados en estas investigaciones son la levadura Saccharomyces cerevisiae y la planta Arabidopsis thaliana. Levaduras y plantas comparten los mecanismos básicos de homeostasis iónica y de tolerancia a estreses y ofrecen ventajas experimentales complementarias.
La metodología empleada es doble: a) genómica funcional para identificar genes cruciales para la homeostasis iónica y tolerancia a estreses abióticos; b) biología molecular y bioquímica para descifrar los mecanismos de los genes anteriores a través de sus proteínas codificadas.
La genómica funcional tiene para nuestro grupo dos ramas complementarias: a) genómica de expresión global de genes mediante micromatrices (“microarrays”); b) genómica de mutación global de genes y selección.
En ambos casos se exponen levaduras o Arabidopsis a situaciones de estrés y se determinan: a) genes regulados, que definirán los mecanismos transcripcionales de respuesta. Esta aproximación está limitada por el hecho conocido de que mucho genes no regulados a nivel transcripcional son sin embargo importantes en los fenómenos biológicos. Por otra parte, muchos genes regulados son poco relevantes para el fenómeno en cuestión; b) mutantes tolerantes se seleccionarán a partir de mutantes marcados (por plásmidos en levadura o por T-DNA en Arabidopsis), que permiten una fácil identificación de los genes responsables.
Los resultados de estas aproximaciones son nuevos genes y mecanismos de respuesta a estreses en levadura y Arabidopsis. Estos conocimientos proporcionan herramientas biotecnológicas para aumentar la tolerancia a estreses en plantas cultivadas y levaduras industriales y dan lugar a patentes.
HISTORIA Y PRINCIPALES LOGROS DEL PASADO
La formación científica de Ramón Serrano (RS) se realizó con tres grandes maestros de la biología moderna: el enzimólogo español Alberto Sols, el bioquímico de membranas norteamericano Efraim Racker y el biólogo molecular norteamericano Gerald R. Fink. La labor investigadora de RS durante más de 25 años puede resumirse como el estudio de los mecanismos de la homeostasis de cationes (H+, K+, Na+) y sus implicaciones en la regulación del crecimiento celular y la tolerancia a estreses.
El primer logro como científico independiente de RS fue la caracterización de la bomba de protones de levaduras y plantas. En las células animales el danés Jens C. Skou (premio Nobel de Química de 1997) había descubierto a finales de los años 50 una ATPasa que acoplaba la hidrólisis de ATP al movimiento de sodio y potasio a través de la membrana plasmática. Sin embargo esta enzima no existe en hongos ni plantas. Los trabajos bioquímicos de RS a principios de los años 80 fueron decisivos para demostrar que la membrana plasmática de hongos y plantas está energizada por una ATPasa electrogénica bombeadora de protones, distinta por tanto de la ATPasa animal identificada por Skou. Estos trabajos se basaron en la purificación de la H+-ATPasa y en la reconstitución de proteoliposomas que catalizaban un bombeo de protones energizado por ATP.
RS fue también pionero en el aislamiento y caracterización del gen que codifica para esta enzima, primero en levadura (1986) y luego en la planta Arabidopsis (1989). La mutagénesis dirigida y al azar del gen de la H+-ATPasa de levadura permitieron definir sus residuos clave así como los dominios funcionales “kinasa” y “fosfatasa” que catalizaban las dos semi-reacciones del ciclo catalítico, con formación e hidrólisis de un intermediario fosforilado. La reciente cristalización de varias enzimas homólogas (la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico sobre todo) ha confirmado la validez de estos postulados.
La manipulación genética de la H+-ATPasa de levadura estableció una correlación entre crecimiento celular y actividad de la bomba de protones. El mecanismo estaría basado tanto en la energización del transporte activo de nutrientes como en la regulación del pH intracelular, un factor clave en la transición G0/G1 del principio del ciclo de división celular de todas las células eucarióticas. Estos resultados pudieron ser parcialmente extrapolados a animales y plantas: la expresión del gen de la H+-ATPasa de levadura en fibroblastos de ratón resultaba en un aumento tanto de su pH intracelular como de su capacidad de crecimiento y en plantas existe una correlación entre el efecto de la hormona de crecimiento auxina y la activación de la H+-ATPasa.
En los años 90 RS inició los estudios de la homeostasis de sodio y potasio con el modelo de levadura, identificando un conjunto de nuevos reguladores codificados por los genes de halotolerancia llamados HAL. La primera diana celular de la toxicidad del Na+ es el producto del gen HAL2. Se trata de una nucleotidasa sensible a litio y sodio que es necesaria para detoxificar un metabolito intermediario, el difosfato de adenosina o PAP, que es altamente tóxico para diversos procesos celulares. RS ha caracterizado una nueva familia de enzimas, las PAP fosfatasas, en animales y plantas. En los primeros resultan ser nuevas dianas, además de la tradicional inositol monofosfatasa, durante la terapia de litio empleada en la enfermedad bipolar. En las segundas, son dianas de la toxicidad del sodio durante el estrés salino.
Los productos de los genes HAL1 y HAL3, HAL4 y HAL5 definen una importante ruta de regulación del transporte de potasio que determina el potencial eléctrico de la membrana y por tanto la toma de cationes tóxicos como litio y sodio. Además estos genes modulan el pH intracelular y la turgencia, definiendo conexiones entre el transporte de potasio, el ciclo de división celular y la regulación de la estabilidad osmótica. El gen HAL3 codifica una nueva flavoproteina que regula tanto el transporte de sodio y potasio como el ciclo celular a través de una proteina fosfatasa de tipo 1 (Ppz1). HAL8/CRZ1 codifica un factor de transcripción que media la acción de la proteina fosfatasa activada por calcio “calcineurina”. Finalmente, el factor de transcripción Sko1 ha sido caracterizado por RS como un represor génico contrarrestado por estrés salino a través de una ruta de MAP kinasas, la ruta HOG. Tanto Hal8 como Sko1 regulan al gen de la bomba de sodio de levadura ENA1.
En levadura RS ha identificado varias proteína kinasas (Ptk2, Hal4, Hal5, Snf1, Sky1) y fosfatasas (Ppz1, Glc7) que regulan el transportador de K+ Trk1 y la H+-ATPasa Pma1. Hal4 y Hal5 también regulan muchos otros transportadores de levadura. Hal3 es una subunidad inhibidora de Ppz1, que a su vez inhibe al transportador de potasio Trk1. Al acidificarse el interior celular Hal3 se une a Ppz1 e impide que inhiba Trk1. El transporte de K+ permite así el balance eléctrico durante la salida de H+ mediada por Pma1. Cuando el pH intracelular vuelve a la neutralidad, Hal3 se separa de Ppz1 que entonces inhibe Trk1 y se para el intercambio salida H+/entrada de K+. Se trata de uno de los primeros sensores de pH identificados a nivel molecular.
FILOSOFÍA DE LA INVESTIGACIÓN
Según Peter Medawar, “la investigación científica es el arte de encontrar problemas importantes que se pueden resolver con las herramientas disponibles”. Pero hay también un aspecto más teórico, resumido por Francis Bacon al decir que “la verdad está más cerca del error que de la confusión”. Es decir, al abordar esos problemas solubles, debemos partir de hipótesis originales que al ser contrastadas supongan un avance importante del conocimiento. Y si son refutadas por erróneas al menos habrán servido de estímulo intelectual. Porque al fin y al cabo, aunque la ciencia sirva al progreso de la sociedad, el motor de todos los descubrimientos importantes ha sido la curiosidad de los científicos por entender la naturaleza. Y aunque el destino no nos lleve a esos descubrimientos importantes necesitamos el estímulo intelectual de poder aspirar a ellos.
LINEAS DE INVESTIGACIÓN ACTUALES
a) acidificación intracelular
El cambio en la concentración intracelular de H+ (pHi) es una señal asociada a muchos procesos biológicos, como por ejemplo el crecimiento y la muerte celular y la respuesta a muchos estreses. Sin embargo, a diferencia de los cambios en la concentración de calcio libre intracelular, apenas se conocen los sistemas celulares que perciben la señal de pHi. Uno de los pocos ejemplos conocidos es el descrito por nuestro grupo: la interacción entre la proteína fosfatasa Ppz1 y su subunidad reguladora Hal3 en levadura, que se favorece a pH bajos permitiendo la activación del transportador de K+ Trk1 (ver más arriba). El sistema de respuesta a cambios del pHi deberá regular también a la H+-ATPasa de membrana plasmática y a los sistemas celulares más sensibles a este parámetro físico-químico, pero se desconocen los mecanismos implicados.
Resultados recientes en levadura indican que la acidificación intracelular moderada tiene como efectos principales la inhibición del transporte de aminoácidos y de las aminoacil-tRNA sintetasas, generándose tRNA descargados. En Arabidopsis hemos identificado nuevos reguladores del transporte de potasio como son la quiescina sulfidril oxidasa QSO2, la prolil isomerasa ROF2 y la beta-adaptina WAT1. La activación de la entrada de potasio es esencial para balance eléctrico durante el bombeo de protones por la H+-ATPasa de membrana plasmática. Hemos demostrado la inhibición de la H+-ATPasa de membrana plasmática de raíces de Arabidopsis por la hormona ácido abscisico, lo que resulta en acidificación intracelular. Esta hormona activa la salida de potasio por el canal GORK y ambos efectos contribuyen a la inhibición de crecimiento. El crecimiento de plántulas mutantes tolerantes a estrés ácido intracelular por aumentar la salida de protones son tolerantes a inhibición por ácido abscísico.
Una acidificación intracelular intensa desencadena la muerte celular programada mediada por acumulación de H2O2 y se han obtenido mutantes tolerantes a este estrés letal y pretendemos caracterizarlos a nivel molecular (identificar el gen mutado).
Este trabajo se realiza en colaboración con los grupos del IBMCP de José R. Murguía, José M. Mulet y Lynne Yenush,) y con el grupo de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga.
b) poliaminas y litio
Las poliaminas y el litio son cationes tóxicos que actúan a concentraciones bajas sin apenas efectos osmóticos. El sodio, sin embargo, resulta tóxico a concentraciones altas en donde se confunden los efectos tóxicos específicos del catión y el estrés osmótico. Utilizando norespermidina como agente de selección se ha identificado una quiescina-sulfhidril oxidase (QSO2) de Arabidopsis que regula positivamente la carga de potasio en el xilema. De forma indirecta y negativamente QSO2 regula la carga y toxicidad de cationes tóxicos como poliaminas, sodio y litio. Estamos investigando la naturaleza del transportador de potasio regulado por QSO2 en la interfaz simplasto-xilema.
También estamos investigando el mecanismo de toxicidad en Arabidopsis de las poliaminas a concentraciones milimolares. Los datos de transcriptómica apuntan a estrés oxidativo, desnaturalización de proteínas e inhibición de la nutrición de nitrato.
Nuestro grupo ha demostrado que la toxicidad del litio en Arabidopsis se debe en gran parte a la inducción de la producción de etileno. Asimismo, la acumulación de H2O2 en un mutante de catalasa da lugar a resistencia a litio por causar pérdida de sensibilidad al etileno. La hipótesis es que la oxidación de grupos sulfhidrilo sensibles en el receptor de etileno ETR1 impide la unión de la hormona y ello habrá de demostrarse mediante estudios del estado de las cisteinas en ETR1 en condiciones normales y durante el estrés oxidativo.
Este trabajo se realiza en colaboración con el grupo de Pedro L. Rodriguez del IBMCP, de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga y de Kalliopi A. Roubelakis-Angelakis de la Universitad de Creta (Grecia).
c) longevidad de semillas y estreses de envejecimiento
Las semillas de las plantas superiores constituyen un sistema biológico de extrema tolerancia a estreses, incluyendo temperatura y desecación. Estamos utilizando un procedimiento de envejecimiento acelerado de semillas de Arabidopsis para seleccionar mutantes con mayor tolerancia a envejecimiento. Tenemos como genes candidatos tres factores de transcripción (AGL18, ZFHD2 y COG1) y una ubiquitina ligasa de la familia RING (que hemos llamado RSL1).Todos ellos aumentan la tolerancia de las semillas al envejecimiento cuando se sobreexpresan y el mecanismo común es reforzar la cubierta de la semilla durante su desarrollo, especialmente la capa de suberina.
d) señalización por metabolismo de azúcares
La H+-ATPasa de membrana plasmática de levaduras y plantas, junto a otros procesos fisiológicos, está regulada por el metabolismo de azúcares, que afecta el estado de fosforilación de la enzima. Perseguimos la hipótesis de que esta regulación se debe a los intermediarios fosforilados de la glicólisis, que en experimentos “in vitro” actúan como inhibidores de la proteína fosfatasa 1 de levadura.
e) frío
Las levaduras cerveceras tipo “lager” pertenecen a la especie Saccharomyces pasterianus y difieren de las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae en su capacidad para realizar la fermentación en frío (10-14 ºC), lo que es esencial para que los aromas de la cerveza sean adecuados. Los mecanismos de tolerancia al frío parecen tener que ver con la estabilidad de los transportadores de nutrientes durante el estrés, especialmente los transportadores de aminoácidos y de fosfato. Vamos a construir una biblioteca de genes de una levadura cervecera cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado y seleccionar genes que confieran tolerancia al frío tras transformar levadura de laboratorio.
Este trabajo se realiza en colaboración con José M. Mulet del IBMCP y con Alfonso Navarro, del Instituto de Alimentos para el Desarrollo de la UPV.
f) TOR, H+-ATPase y transporte de K+
La proteína kinasa TOR es el controlador maestro del crecimiento celular y por tanto estamos considerando la hipótesis de que debe regular positivamente la H+-ATPasa y el transporte de K+. Experimentos iniciales apuntan a regulación transcripcional de la ATPasa y pretendemos determinar ahora cambios en la cantidad y actividad de la enzima.
Este trabajo se realiza en colaboración con Jose M. Mulet del IBMCP y con Christian Meyer del INRA Versalles (Francia).
g) H2O2 y muerte celular
En levadura, la adición de glucosa en ausencia de otros nutrientes provoca muerte celular programada debida a la acumulación de H2O2. La adición de potasio y la disminución de la actividad H+-ATPasa por mutación, disminuyen la producción de H2O2 y protegen frente a esta forma de muerte celular. Esta protección correlaciona con una disminución del potencial eléctrico de las células. La hipótesis que manejamos es que una NAD(P)H oxidasa desconocida de la membrana de levadura es la enzima productora de H2O2 y que se activa por hiperpolarización. El problema ahora es identificar el gen y la proteína de esta actividad en levadura, un organismo que supuestamente no contiene NADPH oxidasas típicas de hongos filamentosos, plantas y animales.
El H2O2 parece actuar activando la salida del potasio celular a través del canal TOK1 y de los transportadores ENA1 y NHA1. Nuestra hipótesis es que al salir el K+ se produce la lisis osmótica de la vacuola, liberando las enzimas líticas de la misma e iniciando la autolisis de las macromoléculas celulares. Los productos de digestión salen de la célula a través de los caminos de permeabilidad de la membrana abiertos por el H2O2 y sirven para alimentar células próximas mejor adaptadas. El demostrar esta hipótesis y detallar sus mecanismos va a ocuparnos bastante tiempo.
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