Mecanismos de la Respuesta
al Estrés en Plantas

Este departamento estudia los mecanismos de respuesta de las plantas al estrés abiótico y biótico. Para ello, empleamos sistemas modelo, como la levadura y Arabidopsis, así como plantas cultivadas económicamente importantes, como el tomate y el brócoli. Nuestros esfuerzos se centran en dilucidar cómo la homeostasis iónica influye en las respuestas al estrés abiótico y los reguladores transcripcionales de estas vías. Otra parte de nuestra investigación está dirigida a la identificación de moléculas, tanto endógenas como de síntesis, que son relevantes para la defensa de las plantas en respuesta al estrés biótico, tolerancia a la sal y a la sequía. También investigamos los mecanismos subyacentes que determinan la longevidad de las semillas tanto en plantas modelo como en plantas cultivadas. Otro aspecto que nos interesa es el estrés vegetal causado por ayuno nutricional, por lo que estudiamos también los mecanismos que, a nivel subcelular, regulan la homeostasis de proteínas en respuesta a estas condiciones de limitación de nutrientes. Mediante la utilización de microorganismos, intentamos descifrar circuitos reguladores moleculares e innovaciones biológicas que pueden servir de base para futuras aplicaciones biotecnológicas. Por otra parte, participamos activamente en la investigación aplicada, asociándonos con empresas del sector Agro-Bio para ayudar a desarrollar herramientas útiles con objeto de identificar variedades resistentes al estrés y estrategias y compuestos biotecnológicos que puedan usarse para mejorar la tolerancia al estrés abiótico y biótico.

Nuestros objetivos son contribuir al conocimiento de la respuesta de las plantas al estrés tanto biótico como abiótico y posteriormente trasladar nuestros descubrimientos a la sociedad mediante la difusión de nuestros resultados y la colaboración con la comunidad científica y la industria. También somos muy activos en la educación STEM y las actividades de divulgación científica.

Áreas de investigación

1- Estrés Abiótico

La investigación en esta área se centra en la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta celular a una variedad de desafíos abióticos, a saber, el estrés iónico, por frío, químico, osmótico y por sequía, así como la falta de nutrientes. Se utiliza una combinación de métodos bioquímicos, genéticos y genómicos para identificar determinantes moleculares y circuitos reguladores que facilitan la adaptación de las plantas a condiciones adversas. El conocimiento de estos determinantes y sus interacciones regulatorias proporcionará herramientas para mejorar la tolerancia de los cultivos a condiciones de estrés abiótico.

Los principales temas que estamos abordando son:

1. Caracterización molecular de las respuestas de estrés celular tanto en organismos modelo (levadura, Arabidopsis) como en cultivos (brócoli, tomate)

Grupos:

  • BiologíaiIntegrativa de sistemas
  • Circuitos reguladores moleculares en respuesta al estrés osmótico
  • Estrés abiótico-Transporte de potasio en estrés abiótico en plantas y levaduras
  • Homeostasis de iones, estrés celular y genómica
  • Proteostasis y estrés en plantas

2. Generación de herramientas biotecnológicas útiles para la tolerancia al estrés abiótico (genes diana, bioestimulantes, biología química, nanocuerpos)

Grupos:

  • Estrés abiótico-Transporte de potasio en estrés abiótico en plantas y levaduras
  • Biología química
  • Circuitos reguladores moleculares en respuesta al estrés osmótico
  • Proteostasis y estrés en plantas

3. Mecanismos moleculares que determinan la longevidad de las semillas en organismos modelo y cultivos

Grupos:

  • Homeostasis de iones, estrés celular y genómica
  • Biología de semillas y tolerancia al estrés

Grupos de Investigación

Interés

Biología Molecular de levadura para la obtención de herramientas biotecnológicas con aplicación en el sector agroalimentario y sanitario.

Líneas de investigación

PRODUCCIÓN DE PEQUEÑOS FORMATOS DE ANTICUERPOS EN LEVADURAS FRENTE A DIFERENTES BACTERIAS DEL SECTOR GANADERO

HOMEOSTASIS MITOCONDRIAL Y ACTIVACION GENICA DURANTE EL ESTRES CELULAR, EL ENVEJECIMIENTO Y LA EVOLUCION


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GENERAL DESCRIPTION OF SCIENTIFIC INTERESTS:

Ion homeostasis is a dynamic process and a fundamental requirement for all organisms. Many different minerals are required for essential biochemical processes, but accumulation of these elements is toxic. Thus, all living organisms have developed efficient systems to acquire and store these elements and robust mechanisms to maintain homeostatic concentrations to avoid toxicity and to respond to environmental changes.

Potassium is a key monovalent cation necessary for multiple aspects of cell growth and survival, for example compensation of negative charges of macromolecules, maintenance of electroneutrality, cell turgor and volume, enzyme activity, protein synthesis, and maintenance of proper membrane potential and intracellular pH. The long term, general goal of our research group is to generate new knowledge regarding the regulation of potassium transporters from both plants and yeast which may be applied in future in biotechnological approaches to improve plant drought tolerance and industrial performance of yeast.

CURRENT PROJECTS:

In plants, apart from the basic, general physiological functions listed above for potassium at the cellular level, this cation also plays a key role at the whole plant level, as it is involved in important processes such as stomatal aperture that controls transpirational water loss and plant desiccation. Inward rectifying channels (Kin) are responsible for potassium influx into guard cells and play a key role in stomatal opening. KAT1, and its close homologue KAT2, are the main inward rectifying channels expressed in guard cells. Our current project is focused on the characterization 14 proteins that we have identified in a Split-Ubiquitin protein-protein interaction screen searching for KAT1 potassium channel interactors from the model plant Arabidopsis thaliana.

We are taking several biochemical and genetic approaches to confirm these interactors and their effect on KAT1 activity in plants. The identification of physiologically relevant regulators of K+ channels will aid in the design of approaches that may impact both drought tolerance and pathogen susceptibility, since these pores are responsible for CO2 uptake and transpirational water loss and are the point of entry for certain pathogens.

In addition we are interested in studying the regulation of the high affinity potassium transporter of yeast, Trk1. The regulation of this transporter is crucial for the regulation of nutrient uptake and, recently, a direct effect of both external and internal potassium and pH on ethanol tolerance in conditions relevant for the industrial production of bioethanol has been reported. In addition, several studies clearly indicate that the proteins involved in determining and maintaining plasma membrane potential through the modulation of potassium homeostasis represent promising targets for complimentary antifungal treatments. Therefore, the identification of proteins that regulate the activity of this potassium transporter has potential applications in both agronomic, industrial and medical contexts.


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El grupo de “Homeostasis Iónica, Estrés Celular y Genómica” tiene como objetivo identificar las bases moleculares de la homeostasis de cationes monovalentes (H+, K+, Na+)  y de los mecanismos de tolerancia a estreses abióticos como la sequía, salinidad, calor, frío, acidez y ambientes oxidantes. Ambos aspectos están relacionados pues durante los estreses celulares hay señales tempranas basadas en flujos opuestos de H+ y K+ y cambios de potencial eléctrico en la membrana plasmática. Por otra parte, el transporte de H+ y K+ regula la tolerancia a estreses, el crecimiento y la muerte celular. Finalmente, es de destacar que los fenómenos biológicos se estudian mejor en condiciones de estrés, que ponen de manifiesto las armas más poderosas de los seres vivos.

Los sistemas modelos empleados en estas investigaciones son la levadura Saccharomyces cerevisiae y la planta Arabidopsis thaliana. Levaduras y plantas comparten los mecanismos básicos de homeostasis iónica y de tolerancia a estreses y ofrecen ventajas experimentales complementarias.

La metodología empleada es doble: a) genómica funcional para identificar genes cruciales para la homeostasis iónica y tolerancia a estreses abióticos; b) biología molecular y bioquímica para descifrar los mecanismos de los genes anteriores a través de sus proteínas codificadas.

La genómica funcional tiene para nuestro grupo dos ramas complementarias: a) genómica de expresión global de genes mediante micromatrices (“microarrays”); b) genómica de mutación global de genes y selección.

En ambos casos se exponen levaduras o Arabidopsis a situaciones de estrés y se determinan: a) genes regulados, que definirán los mecanismos transcripcionales de respuesta. Esta aproximación está limitada por el hecho conocido de que mucho genes no regulados a nivel transcripcional son sin embargo importantes en los fenómenos biológicos. Por otra parte, muchos genes regulados son poco relevantes para el fenómeno en cuestión; b) mutantes tolerantes se seleccionarán a partir de mutantes marcados (por plásmidos en levadura o por T-DNA en Arabidopsis), que permiten una fácil identificación de los genes responsables.

Los resultados de estas aproximaciones son nuevos genes y mecanismos de respuesta a estreses en levadura y Arabidopsis. Estos conocimientos proporcionan herramientas biotecnológicas para aumentar la tolerancia a estreses en plantas cultivadas y levaduras industriales y dan lugar a patentes.

HISTORIA Y PRINCIPALES LOGROS DEL PASADO

La formación científica de Ramón Serrano (RS) se realizó con tres grandes maestros de la biología moderna: el enzimólogo español Alberto Sols, el bioquímico de membranas norteamericano Efraim Racker y el biólogo molecular norteamericano Gerald R. Fink. La labor investigadora de RS durante más de 25 años puede resumirse como el estudio de los mecanismos de la homeostasis de cationes (H+, K+, Na+) y sus implicaciones en la regulación del crecimiento celular y la tolerancia a estreses.

El primer logro como científico independiente de RS fue la caracterización de la bomba de protones de levaduras y plantas. En las células animales el danés Jens C. Skou (premio Nobel de Química de 1997) había descubierto a finales de los años 50 una ATPasa que acoplaba la hidrólisis de ATP al movimiento de sodio y potasio a través de la membrana plasmática. Sin embargo esta enzima no existe en hongos ni plantas. Los trabajos bioquímicos de RS a principios de los años 80 fueron decisivos para demostrar que la membrana plasmática de hongos y plantas está energizada por una ATPasa electrogénica bombeadora de protones, distinta por tanto de la ATPasa animal identificada por Skou. Estos trabajos se basaron en la purificación de la H+-ATPasa y en la reconstitución de proteoliposomas que catalizaban un bombeo de protones energizado por ATP.

RS fue también pionero en el aislamiento y caracterización del gen que codifica para esta enzima, primero en levadura (1986) y luego en la planta Arabidopsis (1989). La mutagénesis dirigida y al azar del gen de la H+-ATPasa de levadura permitieron definir sus residuos clave así como los dominios funcionales “kinasa” y “fosfatasa” que catalizaban las dos semi-reacciones del ciclo catalítico, con formación e hidrólisis de un intermediario fosforilado. La reciente cristalización de varias enzimas homólogas (la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico sobre todo) ha confirmado la validez de estos postulados.

La manipulación genética de la H+-ATPasa de levadura estableció una correlación entre crecimiento celular y actividad de la bomba de protones. El mecanismo estaría basado tanto en la energización del transporte activo de nutrientes como en la regulación del pH intracelular, un factor clave en la transición G0/G1 del principio del ciclo de división celular de todas las células eucarióticas. Estos resultados pudieron ser parcialmente extrapolados a animales y plantas: la expresión del gen de la H+-ATPasa de levadura en fibroblastos de ratón resultaba en un aumento tanto de su pH intracelular como de su capacidad de crecimiento y en plantas existe una correlación entre el efecto de la hormona de crecimiento auxina y la activación de la H+-ATPasa.

En los años 90 RS inició los estudios de la homeostasis de sodio y potasio con el modelo de levadura, identificando un conjunto de nuevos reguladores codificados por los genes de halotolerancia llamados HAL. La primera diana celular de la toxicidad del Na+ es el producto del gen HAL2. Se trata de una nucleotidasa sensible a litio y sodio que es necesaria para detoxificar un metabolito intermediario, el difosfato de adenosina o PAP, que es altamente tóxico para diversos procesos celulares. RS ha caracterizado una nueva familia de enzimas, las PAP fosfatasas, en animales y plantas. En los primeros resultan ser nuevas dianas, además de la tradicional inositol monofosfatasa, durante la terapia de litio empleada en la enfermedad bipolar. En las segundas, son dianas de la toxicidad del sodio durante el estrés salino.

Los productos de los genes HAL1 HAL3HAL4 y HAL5 definen una importante ruta de regulación del transporte de potasio que determina el potencial eléctrico de la membrana y por tanto la toma de cationes tóxicos como litio y sodio. Además estos genes modulan el pH intracelular y la turgencia, definiendo conexiones entre el transporte de potasio, el ciclo de división celular y la regulación de la estabilidad osmótica. El gen HAL3 codifica una nueva flavoproteina que regula tanto el transporte de sodio y potasio como el ciclo celular a través de una proteina fosfatasa de tipo 1 (Ppz1). HAL8/CRZ1 codifica un factor de transcripción que media la acción de la proteina fosfatasa activada por calcio “calcineurina”. Finalmente, el factor de transcripción Sko1 ha sido caracterizado por RS como un represor génico contrarrestado por estrés salino a través de una ruta de MAP kinasas, la ruta HOG. Tanto Hal8 como Sko1 regulan al gen de la bomba de sodio de levadura ENA1.

En levadura RS ha identificado varias proteína kinasas (Ptk2, Hal4, Hal5, Snf1, Sky1) y fosfatasas (Ppz1, Glc7) que regulan el transportador de K+ Trk1 y la H+-ATPasa Pma1. Hal4 y Hal5 también regulan muchos otros transportadores de levadura. Hal3 es una subunidad inhibidora de Ppz1, que a su vez inhibe al transportador de potasio Trk1. Al acidificarse el interior celular Hal3 se une a Ppz1 e impide que inhiba Trk1. El transporte de K+ permite así el balance eléctrico durante la salida de H+ mediada por Pma1. Cuando el pH intracelular vuelve a la neutralidad, Hal3 se separa de Ppz1 que entonces inhibe Trk1 y se para el intercambio salida H+/entrada de K+. Se trata de uno de los primeros sensores de pH identificados a nivel molecular.

FILOSOFÍA DE LA INVESTIGACIÓN

Según Peter Medawar, “la investigación científica es el arte de encontrar problemas importantes que se pueden resolver con las herramientas disponibles”. Pero hay también un aspecto más teórico, resumido por Francis Bacon al decir que “la verdad está más cerca del error que de la confusión”. Es decir, al abordar esos problemas solubles, debemos partir de hipótesis originales que al ser contrastadas supongan un avance importante del conocimiento. Y si son refutadas por erróneas al menos habrán servido de estímulo intelectual. Porque al fin y al cabo, aunque la ciencia sirva al progreso de la sociedad, el motor de todos los descubrimientos importantes ha sido la curiosidad de los científicos por entender la naturaleza. Y aunque el destino no nos lleve a esos descubrimientos importantes necesitamos el estímulo intelectual de poder aspirar a ellos.

LINEAS DE INVESTIGACIÓN ACTUALES

a) acidificación intracelular

El cambio en la concentración intracelular de H+ (pHi) es una señal asociada a muchos procesos biológicos, como por ejemplo el crecimiento y la muerte celular y la respuesta a muchos estreses. Sin embargo, a diferencia de los cambios en la concentración de calcio libre intracelular, apenas se conocen los sistemas celulares que perciben la señal de pHi. Uno de los pocos ejemplos conocidos es el descrito por nuestro grupo: la interacción entre la proteína fosfatasa Ppz1 y su subunidad reguladora Hal3 en levadura, que se favorece a pH bajos permitiendo la activación del transportador de K+ Trk1 (ver más arriba). El sistema de respuesta a cambios del pHi  deberá regular también a la H+-ATPasa de membrana plasmática y a los sistemas celulares más  sensibles a este parámetro físico-químico, pero se desconocen los mecanismos implicados.

Resultados recientes en levadura indican que la acidificación intracelular moderada tiene como efectos principales la inhibición del transporte de aminoácidos y de las aminoacil-tRNA sintetasas, generándose tRNA descargados. En Arabidopsis hemos identificado nuevos reguladores del transporte de potasio como son la quiescina sulfidril oxidasa QSO2, la prolil isomerasa ROF2 y la beta-adaptina WAT1. La activación de la entrada de potasio es esencial para balance eléctrico durante el bombeo de protones por la H+-ATPasa de membrana plasmática. Hemos demostrado la inhibición de la H+-ATPasa de membrana plasmática de raíces de Arabidopsis por la hormona ácido abscisico, lo que resulta en acidificación intracelular. Esta hormona activa la salida de potasio por el canal GORK y ambos efectos contribuyen a la inhibición de crecimiento. El crecimiento de plántulas mutantes tolerantes a estrés ácido intracelular por aumentar la salida de protones son tolerantes a inhibición por ácido abscísico.

Una acidificación intracelular intensa desencadena la muerte celular programada mediada por acumulación de H2O2 y se han obtenido mutantes tolerantes a este estrés letal y pretendemos caracterizarlos a nivel molecular (identificar  el gen mutado).

Este trabajo se realiza en colaboración con los grupos del IBMCP de José R. Murguía, José M. Mulet y Lynne Yenush,) y con el grupo de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga.

b) poliaminas y litio

Las poliaminas y el litio son cationes tóxicos que actúan a concentraciones bajas sin apenas efectos osmóticos. El sodio, sin embargo, resulta tóxico a concentraciones altas en donde se confunden los efectos tóxicos específicos del catión y el estrés osmótico. Utilizando norespermidina como agente de selección se ha identificado una quiescina-sulfhidril oxidase (QSO2) de Arabidopsis que regula positivamente la carga de potasio en el xilema. De forma indirecta y negativamente QSO2 regula la carga y toxicidad de cationes tóxicos como poliaminas, sodio y litio. Estamos investigando la naturaleza del transportador de potasio regulado por QSO2 en la interfaz simplasto-xilema.

También estamos investigando el mecanismo de toxicidad en Arabidopsis de las poliaminas a concentraciones milimolares. Los datos de transcriptómica apuntan a estrés oxidativo, desnaturalización de proteínas e inhibición de la nutrición de nitrato.

Nuestro grupo ha demostrado que la toxicidad del litio en Arabidopsis se debe en gran parte a la inducción de la producción de etileno. Asimismo, la acumulación de H2O2 en un mutante de catalasa da lugar a resistencia a litio por causar pérdida de sensibilidad al etileno. La hipótesis es que la oxidación de grupos sulfhidrilo sensibles en el receptor de etileno ETR1 impide la unión de la hormona y ello habrá de demostrarse mediante estudios del estado de las cisteinas en ETR1 en condiciones normales y durante el estrés oxidativo.

Este trabajo se realiza en colaboración con el grupo de Pedro L. Rodriguez del IBMCP, de José A. Fernandez y María J. García-Sanchez de la Universidad de Málaga y de Kalliopi A. Roubelakis-Angelakis de la Universitad de Creta (Grecia).

c) longevidad de semillas y estreses de envejecimiento

Las semillas de las plantas superiores constituyen un sistema biológico de extrema tolerancia a estreses, incluyendo temperatura y desecación. Estamos utilizando un procedimiento de envejecimiento acelerado de semillas de Arabidopsis para seleccionar mutantes con mayor tolerancia a envejecimiento. Tenemos como genes candidatos tres factores de transcripción (AGL18, ZFHD2 y COG1) y una ubiquitina ligasa de la familia RING (que hemos llamado RSL1).Todos ellos aumentan la tolerancia de las semillas al envejecimiento cuando se sobreexpresan y el mecanismo común es reforzar la cubierta de la semilla durante su desarrollo, especialmente la capa de suberina.

d) señalización por metabolismo de azúcares

La H+-ATPasa de membrana plasmática de levaduras y plantas, junto a otros procesos fisiológicos, está regulada por el metabolismo de azúcares, que afecta el estado de fosforilación de la enzima. Perseguimos la hipótesis de que esta regulación se debe a los intermediarios fosforilados de la glicólisis, que en experimentos “in vitro” actúan como inhibidores de la proteína fosfatasa 1 de levadura.

e) frío

Las levaduras cerveceras tipo “lager” pertenecen a la especie Saccharomyces pasterianus y difieren de las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae en su capacidad para realizar la fermentación en frío (10-14 ºC), lo que es esencial para que los aromas de la cerveza sean adecuados. Los mecanismos de tolerancia al frío parecen tener que ver con la estabilidad de los transportadores de nutrientes durante el estrés, especialmente los transportadores de aminoácidos y de fosfato. Vamos a construir una biblioteca de genes de una levadura cervecera cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado y seleccionar genes que confieran tolerancia al frío tras transformar levadura de laboratorio.

Este trabajo se realiza en colaboración con José M. Mulet del IBMCP y con Alfonso Navarro, del Instituto de Alimentos para el Desarrollo de la UPV.

f) TOR, H+-ATPase y transporte de K+

La proteína kinasa TOR es el controlador maestro del crecimiento celular y por tanto estamos considerando la hipótesis de que debe regular positivamente la H+-ATPasa y el transporte de K+. Experimentos iniciales apuntan a regulación transcripcional de la ATPasa y pretendemos determinar ahora cambios en la cantidad y actividad de la enzima.

Este trabajo se realiza en colaboración con Jose M. Mulet del IBMCP y con Christian Meyer del INRA Versalles (Francia).

g) H2O2 y muerte celular

En levadura, la adición de glucosa en ausencia de otros nutrientes provoca muerte celular programada debida a la acumulación de H2O2. La adición de potasio y la disminución de la actividad H+-ATPasa por mutación, disminuyen la producción de H2O2 y protegen frente a esta forma de muerte celular. Esta protección correlaciona con una disminución del potencial eléctrico de las células. La hipótesis que manejamos es que una NAD(P)H oxidasa desconocida de la membrana de levadura es la enzima productora de H2O2 y que se activa por hiperpolarización. El problema ahora es identificar el gen y la proteína de esta actividad en levadura, un organismo que supuestamente no contiene NADPH oxidasas típicas de hongos filamentosos, plantas y animales.

El H2O2 parece actuar activando la salida del potasio celular a través del canal TOK1 y de los transportadores ENA1 y NHA1. Nuestra  hipótesis es que al salir el K+ se produce la lisis osmótica de la vacuola, liberando las enzimas líticas de la misma e iniciando la autolisis de las macromoléculas celulares. Los productos de digestión salen de la célula a través de los caminos de permeabilidad de la membrana abiertos por el H2O2 y sirven para alimentar células próximas mejor adaptadas. El demostrar esta hipótesis y detallar sus mecanismos va a ocuparnos bastante tiempo.


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OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

El impacto causado por el cambio climático y el aumento de la población, supone un riesgo elevado para la provisión de alimentos basados en la producción agrícola. Esta amenaza nos impulsa a estudiar la respuesta de las plantas a condiciones ambientales desfavorables, con el objetivo de incrementar la producción vegetal en un escenario adverso para la agricultura.

Nuestro objetivo general es el estudio de los mecanismos moleculares de las plantas para regular sus procesos de crecimiento, productividad y adaptación ambiental. El conocimiento generado mediante abordajes multidisciplinares como la genética, bioquímica, fisiología, biología molecular y celular principalmente con la planta modelo Arabidopsis thaliana, ayudará a descifrar los mecanismos implicados.

A nivel subcelular nos centramos en los estudios de proteostasis, es decir, la regulación de la homeostasis de las proteínas, incluyendo los procesos de síntesis, modificación, transporte y degradación. Nuestro laboratorio se centra en el estudio de cómo la proteostasis vegetal define el adecuado balance entre el crecimiento, modulado por los ejes SnRK1-TOR y/o espermidina/eIF5A, y la adaptación a múltiples condiciones de estrés tales como deficiencia nutricional, la sequía o la presencia de agentes patógenos. Dado el alto grado de conservación y relevancia de estos ejes moleculares reguladores entre los eucariotas, esperamos que los resultados obtenidos permitan descubrir principios básicos de regulación celular y, al mismo tiempo, proveer de soluciones biotecnológicas para mejorar la adaptación y tolerancia de las plantas al estrés.

PLATAFORMAS TECNOLÓGICAS. Para llevar a cabo nuestras actividades de investigación, hemos implementado tecnologías para estudios de interacciones proteicas (BiFC) y también para estudios de traducción de alta resolución (Riboseq):

– Estudios de interacciones de proteínas por BiFC (Complementación Bimolecular de Fluorescencia). Hemos diseñado y validado nuestros propios vectores para BiFC (http://www.ibmcp.upv.es/PlantStressProteostasisLabVectors) que permiten la generación de fusiones traduccionales a proteínas fluorescentes mediante tecnología de clonaje Gateway. Estos vectores permiten la visualización de interacciones proteicas in vivo en células vegetales por reconstitución de la fluorescencia.

– Estudios del traductoma mediante perfil de huella ribosomal (Riboseq). Hemos implementado la tecnología Riboseq que permite el estudio global de traducción de ARNm a nivel de sub-codón, por secuenciación masiva de fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas.


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Molecular Mechanisms determining Seed Longevity

Understanding how seeds remain viable for years and how they deteriorate, and why some seeds remain viable longer than others is a fascinating subject that can be studied from the scientific point of view, but also with an enormous potential in oriented research, given the economic importance of the seed market and the low seed life span of many species. Seed longevity can be seen as a process where plant responses to both biotic and abiotic stresses are intermingled. Contrary to classical stress situations, is not the plant, but the metabolically inert dry seed which has to be prepared and resist the stressful conditions. Also peculiar is the fact that the new germinating seed has to cope with the consequences of a stress that occurred to the embryo in the past, not in real time. Moreover, it is an aspect of stress biology that integrates passive and active responses, protection and repair, and where development (seed maturation, germination, plant establishment) and stress research are combined.

 

In the last years, our group has initiated the search of new players contributing to the genetic component of seed longevity. Using the model plant Arabidopsis thaliana, we want to identify genes relevant for resistance to seed deterioration, and to characterise their mode of action. From the scientific point of view, our interest is to understand how the seed is prepared during maturation to cope with aging, and how the emerging seedling repairs the damage accumulated during the aging period.  Currently, several processes are being studied in detail: 1) How the environment during seed development influence seed longevity and other seed properties. We pretend to unravel the effects of the environment during seed development on seed longevity, and to identify the regulatory pathways transducing environmental signals and the downstream processes and genes involved. Our results will allow a major control of seed viability, allowing future improved agricultural practices and seed preservation management programmes.  2) What is the role of flavonoids in seed protection and their connection with testa development. Besides their supposed as antioxidants, these compounds may be acting as signalling molecules  3) We also use natural variation to identify new processed involved in seed longevity. From the oriented point of view, we are interested in knowing why and how different industrial seed treatments and coatings are affecting seed quality, and providing suggestions to seed companies in order to improve seed life span and seed quality.

 

Bacterial Effector and Plant-Pathogen Interaction

The discovery of new translocated plant effectors and the characterization of their activities, or the mechanisms by which they are recognized by the plant immune system is a second line of research in my group. Here, we are focused mainly on citrus-pathogen interactions. Xanthomonas citri is the causal agent of citrus canker. This bacterium uses transcriptional-activator like effectors (TALEs) to facilitate infection. The way the plant activates defence responses in response to specific TALEs has been investigated in our group during the last years. Our main objective here is to identify R genes triggering a hypersensitive response mediated by TALE-avirulence factors. HLB (Huanglongbing) is a devastating disease in Citrus, caused by bacteria of the Liberibacter genus. We are testing the role of putative bacterial effectors using heterologous systems, and using transcriptomics to characterize the plant responses to these bacteria in susceptible and resistant interactions.


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Water availability is a major limitation for crop productivity. Over 34 % of crop and livestock production loss is traced to drought, costing the sector $37 billion overall. Our group applies chemical biology to understand drought tolerance and to develop biotechnological tools to fight climate change. In an attempt to make discoveries with an impact in agriculture, we study different plant species including maize, rice and tomato but also model plants like Arabidopsis and the C4-monocot model Setaria viridis. During the last years we have followed a drug discovery approach to design, screen, synthesize and evaluate small molecules able to activate drought resistance in crops. Structure-guided ligand design is a powerful approach, no frequently used in plant biology, which has allowed us to develop potent ABA-receptor agonists. We are collaborating with the private sector to further improve these compounds. In the next years, we will extend our research to different targets in order to develop novel chemical probes with biotechnological interest.


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2- Señalización y Respuestas al Estrés Biótico

Esta área de investigación se centra en los mecanismos implicados en la resistencia de las plantas al estrés biótico. Se emplean distintos enfoques con el objetivo de estudiar la función de genes, proteínas y metabolitos involucrados en la respuesta de la planta a los ataques de patógenos. Estos estudios nos permitirán ampliar nuestro conocimiento sobre el sistema defensivo de las plantas y generar nuevas estrategias biotecnológicas para el control de enfermedades de las plantas que, a su vez, permitan aplicar prácticas agrícolas más sostenibles y respetuosas con el medio ambiente.

Las principales áreas de investigación son:

1. Mecanismos moleculares implicados en las interacciones planta-patógeno (bacterias y viroides)

Grupos:

  • Señalización y respuesta al estrés biótico
  • Biología de semillas y tolerancia al estrés
  • Proteostasis y estrés en plantas

2. Caracterización de metabolitos naturales involucrados en la interacción de la planta con patógenos y su desarrollo como herramientas biotecnológicas.

Grupos:

  • Señalización y respuesta al estrés biótico
  • Proteostasis y estrés en plantas

Grupos de Investigación

La investigación de nuestro grupo se centra en el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia de las plantas a agentes bióticos (viroides, virus, bacterias, hongos) empleando abordajes bioquímicos, moleculares y metabolómicos, con el objetivo de conocer la función de genes, proteínas y metabolitos implicados en la respuesta de la planta al ataque por distintos patógenos.

En la actualidad, estamos explorando la implicación, tanto en la comunicación intra como inter planta,  de tres grupos de moléculas señal  que participan en la respuesta del tomate contra las bacterias: (1) el ácido salicílico y su éster metílico, (2) monoterpenoides y ( 3) ésteres de volátiles de hojas verdes.

1.– Hemos llevado a cabo un análisis metabólico mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas en la respuesta defensiva de plantas de tomate ‘Rio Grande’ Pto infectadas con dos cepas de la bacteria patógena Pseudomonas syringæ pv. tomato DC3000. Una de ellas es portadora del gen AvrPto y como consecuencia la planta es resistente a la infección (interacción incompatible), mientras que la otra que no contiene dicho gen, da lugar a una interacción compatible con fuertes síntomas en las hojas infectadas. La comparación de los perfiles metabolómicos de hojas infectadas con uno u otro tipo de bacterias reveló diferencias muy significativas entre los compuestos volátiles (VOCs) asociados a cada tipo de infección. En concreto, en la interacción incompatible, las hojas emitían ésteres del (Z)-3-hexenol, tales como acetato de (Z)-3-hexenilo y butanoato de (Z)-3-hexenilo, así como monoterpenos hidroxilados, como α-terpineol, 4-terpineol y linalool. En cambio, en la interacción compatible, con fuertes síntomas de la enfermedad bacteriana, se observó la emisión de salicilato de metilo y monoterpenos como el limoneno y el α-pineno (López-Gresa et al. 2017).

Además, hemos encontrado que algunos de estos VOCs muestran actividad antibiótica in vitro contra Pseudomonas y que el tratamiento exógeno de las plantas de tomate con estos compuestos provocaron la inducción de genes defensivos y el cierre de estomas en hojas de tomate, así como un aumento muy significativo de la resistencia de dichas plantas a la infección por Pseudomonas (López-Gresa et al. 2018). Estos resultados sugieren que estos VOCs podrían tener un doble papel en plantas de tomate: como moléculas protectoras y como inductores de defensa. Además, debido a su naturaleza química, también podrían desempeñar una función biológica en la comunicación entre plantas a través de la atmósfera. Hemos presentado una patente (PCT / ES2018 / 070) sobre el uso y el método de aplicación del butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) como un metabolito inductor del cierre de estomas para proteger las plantas contra el ataque de patógenos en general y sequía. Además de este papel biológico, nuestros últimos resultados (Payá et al. 2020) muestran que la aplicación exógena de HB en vid (Vitis vinifera) acelera la maduración.

2.- Hemos demostrado la inducción de la expresión de diferentes factores de traducción y proteínas ribosómicas como consecuencia de la infección por Citrus Exocortis Viroid (CEVd) en plantas de tomate. Este resultado indica que un patógeno no codificante causa cambios en la maquinaria transcripcional. En particular, se identificaron los factores de alargamiento 1 y 2 (eEF1A y eEF2) y el factor de iniciación de la traducción 5-alfa (eIF5A). Así mismo, se demostró una interacción reproducible entre eEF1A y el CEVd (Lisón et al. 2013).

Más recientemente hemos demostrado que el CEVd produce estrés ribosomal en plantas de tomate (Cottilli et al. 2019). Nuestros últimos resultados (Vazquez et al. 2020) empleando mutantes de tomate Never ripe (Nr) insensibles a etileno sugieren un papel importante de esta fitohormona en el estrés ribosomal causado por la infección viroidal.

3.- Hemos demostrado el papel de flavonoides y amidas de ácidos hidroxicinámicos (HCAA) en la defensa de plantas de tomate contra virus (Campos et al. 2019) y la bacteria patógena Pseudomonas syringae DC3000 (Zacarés et al. 2007, López-Gresa et al. 2011, Campos et al. 2014b), respectivamente.

Hemos identificado nuevos compuestos de naturaleza fenólica cuya síntesis es inducida tanto en interacciones compatibles como de naturaleza incompatible entre plantas de tomate y determinados patógenos. Uno de estos metabolitos, la trans-feruloilnoradrenalina (t-FNA), es un nuevo compuesto con una potente actividad antioxidante (Patente Internacional WO2011ES70269 20110415). Las plantas transgénicas de tomate que sobreexpresan el gen THT, un gen clave para la biosíntesis de HCAA, mostraron una mayor resistencia a Pseudomonas syringae DC3000.

4.- Hemos obtenido evidencia sólida de que el ácido gentísico (GA), un derivado metabólico del ácido salicílico (SA), actúa como una señal complementaria adicional al SA para activar las defensas de las plantas de tomate contra los patógenos (López-Gresa et al. 2016; Bellés et al. 1999). También hemos encontrado que GA y SA podrían tener un papel como moléculas señal en el silenciamiento del RNA contra virus y viroides (Campos et al. 2014a, López-Gresa et al. 2016). Más recientemente, hemos demostrado que el GABA juega un papel defensivo en la respuesta de plantas de tomate al CEVd (López-Gresa et al. 2019).


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